干细胞:什么是胚胎干细胞?治疗效果如何

2020-03-19

胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）是从植入前胚胎的胚泡内细胞群或原始生殖嵴（primordial germ cells，PGCs）中经分离得到的具有全能性或多能性的一类干细胞。ESCs在体内外环境下均可被诱导分化为机体的几乎全部类型细胞，因此，ESCs对研究哺乳动物和人的胚胎发生、组织分化、药物筛选、移植治疗、基因治疗、转基因动物等领域具有重大意义。

一、ESCs的研究历史

对胚胎干细胞的研究源于小鼠的畸胎瘤细胞（embryonic carcinoma cells），又称EC细胞。早在1958年，Stevens通过移植畸胎瘤到“129品系”小鼠的精巢或肾脏被膜下，获得了EC细胞，1981年Evans和Kaufman首次建立了小鼠胚胎干细胞系，1998年是干细胞研究史上的具有里程碑意义的一年，因为在这一年Thomson等从人胚泡的内胚层细胞团（Inner cell mass，ICM）成功的分离并培养出了第一株人类胚胎干细胞，同时Shamblott也从5～6周胎儿生殖嵴组织成功分离培养出第一例人类胚胎生殖细胞株（Embryonic germ cell），建立了人多能干细胞细胞株，同时人们对胚胎干细胞的研究重点也从建立转基因动物转到如何诱导胚胎干细胞向特定的方向转化上来。

2001年美国马萨诸塞州先进细胞技术公司把干细胞用于治疗性克隆，并通过克隆技术培育出人类早期胚胎。这样就使科学家利用人类ESCs治疗各种疾病成为可能。从此对胚胎干细胞研究进入了一个新的时代。最新研究发现，成体干细胞也可以横向分化为其他类型的细胞和组织，为干细胞的广泛应用提供了基础。2005年1月，威斯康星—麦迪逊大学的专家宣布，把干细胞转换为脊椎神经细胞。2月，伊利诺易斯大学专家宣布，胚胎干细胞可改变面容，可培养隆胸移植物。5月，加利福尼亚大学的研究表明，瘫痪老鼠的脊椎接受了人类胚胎干细胞治疗后，恢复爬行。

二、ESCs的生物学特性

2.1 ESCs的形态学特点
ESCs体积小，形态与早期胚胎细胞相似，细胞核大，核内可见一或几个核仁。体外抑制分化培养的ESCs则排列紧密，细胞界限不清，呈鸟巢集落状生长，集落的边界清晰可见。

2.2 ESCs的其他特性
ESCs具有全能性，即具有分化为机体各种细胞和形成各种组织的特性；ESCs全能性的标志是表达特异性胚胎抗原SSEA-3、SSEA-4，肿瘤排斥抗原TRA1-60、TRA-1-81以及转录因子Oct-3、Oct-4。ESCs具有无限增殖性。ESCs是否分化可以依据AFP和端粒酶活性以及某些分子标志物（TDGF、Oct3、Oct4等）的表达来判定，如果活性增高或表达增强，则表明ESCs处于未分化状态。ESCs能在相应的体外条件下分化成多种细胞系，可作为研究各种体细胞发育问题的模型。ESCs具有遗传稳定性，即发育全能性等遗传性能，经基因改造操作后并不会随之改变。

三、ESCs的建系与培养

3.1 ESCs的建系
可采用从早期胚胎生殖腺中分离ESCs或采用克隆技术将体细胞的细胞核移植到去核后的卵母细胞中，在发育到囊胚阶段时，从其内细胞群细胞中分离。利用早期胚胎生殖腺中分离技术已经建立了大鼠、兔、灵长类等动物和人类的ESCs系；采用克隆技术已经建立了小鼠、山羊等动物和人类的ESCs系。目前建立的人类ESCs株主要来源于临床治疗不孕症进行胚胎移植时患者捐献的多余的胚胎和人工流产的5~9周胎儿，经反复传代，最终建成人ESCs系。

3.2 ESCs的培养
3.2.1 常规培养液
常用的有DMEM、MEM-α和组织培养基（TCM）-199等合成培养基，其中DMEM最为常用。

3.2.2 无血清培养液
ESCs增殖速度快，消耗的营养物质多，所以其培养液中常加入胎牛血清等高营养物质，但血清中含多种成分，其中有些是可诱导ESCs分化的因子，影响ESCs在增殖过程中未分化状态的保持。为此科研人员使用合成培养液、无血清培养液进行ESCs的培养，发现ESCs同样增殖旺盛，因此认为无血清培养液优于含血清培养液，但也有研究者认为含血清的培养液更有利于ESCs分化为中胚层细胞。

3.2.3 饲养层
该培养体系的建立是ESCs培养建系中应用最多的方法，饲养层细胞采用丝裂霉素-C或射线处理后，细胞会丧失增殖能力，但仍能存活，并可合成和释放促进细胞有丝分裂的成纤维细胞生长因子等一些必需因子。现阶段最常用的饲养层是MEF，但也有研究者认为，饲养层技术产生的一些细胞因子会使ESCs的临床应用受影响。有研究者报道，采用人骨髓基质干细胞作为饲养层细胞进行人ESCs的培养传代，发现ESCs能长期保持未分化状态。

四、ESCs的定向分化及其机制

ESCs可在体外诱导分化为内、中、外三个胚层的多种细胞，包括神经细胞、造血干细胞、心肌细胞和内皮细胞等。现阶段，ESCs诱导分化的方法主要有生长因子诱导分化、转基因诱导分化和细胞共培养诱导分化。ESCs的分化受各种内、外因素的共同影响，其中细胞内基因表达调控是决定分化的最主要因素。

4.1 ESCs定向分化成神经细胞
有科研人员将人ESCs培养至拟胚体（EBs）后，将培养基换成神经细胞培养基，再将分离得到的已分化的EBs细胞放入含碱性成纤维生长因子的培养基中培养，最终获得接近100%表达神经元标志的细胞。也有学者采用贴壁的细胞分化方法诱导同源饲养层培养的人ESCs定向分化，获得具有分化为神经元和神经胶质细胞能力的高浓度神经前体细胞。

4.2 ESCs定向分化成心肌细胞
研究证明，TGF、BMP、FGF、RA、DMSO、VitC、ICA和淫羊藿苷等均可以诱导ESCs分化为心肌细胞，将人ESCs体外诱导分化获得的心肌细胞培养3个月，发现随着培养时间的延长，分化的心肌细胞越来越接近于成熟的心肌细胞。

五、ESCs的应用

ESCs及其体外分化模型能够模拟胚胎正常发育进程，在发育生物学、转基因动物的生产、克隆动物、动物和人类疾病模型的建立、药物的开发和筛选、基因治疗、细胞组织和器官的修复和移植治疗等方面都有广泛的应用前景。

5.1 研究胚胎发育及疾病的发生
许丹等证明用ESCs培养体系对小鼠的早期胚胎进行培养，可以显著提高小鼠早期胚胎的发育率。还可以通过胚胎干细胞建立体外分化模型，并建立各种基因改变的胚胎干细胞系，以求发现某些基因或细胞因子在胚胎发育早期对不同类型细胞或组织分化的作用。人体胚胎干细胞可用于研究人胚的早期发育，因为早期人胚发育过程尚不明了，能导致先天性缺陷和胎盘异常而导致流产的事件。研究体外培养的胚胎干细胞，可以鉴定引致这些问题的遗传学、分子生物学和细胞学事件，并确定如何预防其发生，也可用于探索胚胎早期发育中染色体的异常，包括检测早期儿童肿瘤的发生。

5.2 用于细胞、组织的修复和移植治疗
ESCs最诱人的前景和用途是生产组织和细胞，因为它具有发育分化成构成机体的所有类型组织细胞的能力，任何因物理、化学或生物因素等造成的细胞损伤或病变引起的疾病都可以通过移植由ESCs定向分化而来的特异组织细胞或器官来治疗。并且，通过控制胚胎干细胞生长环境、向胚胎干细胞转染某一种系细胞形成的决定基因等，可获得数量不受限制的特定种系的较纯化的细胞，为细胞移植提供源源不尽的无免疫性的材料。如果这些细胞用于移植治疗，将给帕金森氏病、脊髓损伤、糖尿病、心肌损伤、肝硬化、肾衰竭、各种血液疾病等疑难病症的治疗带来新的希望。

5.3 用于基因治疗
通过将人胚胎干细胞定向诱导分化成所需的细胞、组织、器官，不仅解决了移植材料来源困难问题，又可以对干细胞的基因做某些修改，即破坏细胞中表达组织相容性复合物的基因，以躲避受者免疫系统的监视，从而防止免疫排斥反应的发生。另一种克服移植免疫排斥反应的设想是结合克隆技术创建患者特异性的干细胞，用这种干细胞培养获得的细胞、组织或器官，其基因和细胞膜表面的主要组织相容性复合体与患者的完全一致，不会导致免疫排斥反应。

另外，利用基因打靶技术使外源性DNA与胚胎干细胞中的相应部分重组，或靶向破坏等位基因造成基因纯合失效来治疗某些遗传性疾病，具有基因转移效率高、易于操作的优点。人体胚胎干细胞可作为开发遗传工程的一种新方法。当前小鼠ESCs的体外遗传互补极易通过同源重组技术实现，这是一种替换或添加基因的技术，它需要人为地将一个DNA分子导入基因组并表达它。利用这一方法，诱导分化成特定类型细胞的基因或表达所需蛋白产物的基因可以被导入ESCs。如果利用人ESCs使这一技术得以开发，则可设计出基因治疗的好方法。

5.4 用于药物筛选和药物开发
新药在临床使用前需要进行一系列的检测和实验，这些实验都依靠动物来完成，但是动物模型实验不可能完全反映药物对人体细胞的作用。胚胎干细胞能模拟体内细胞或组织对被检测药物的反应，使结果更接近真实情况，从而提供更安全、更有效、更经济的药物筛选模型。

于洲等对建立的胚胎干细胞神经发育毒性评价模型的研究证明，其可以作为体外发育毒性评价方法对神经发育毒物进行筛选。此外，由于ESCs类似于早期胚胎组织，它还可用来揭示哪些药物会干扰胎儿的发育，引起出生缺陷。并且还可利用人胚胎干细胞建立人类疾病模型，在分子水平上研究疾病的发生机制，帮助寻找更有效的治疗方法和药物。

六、ESCs存在的主要问题及展望

6.1 ESCs的定向分化及分化细胞的分离纯化
细胞分化是多种细胞因子相互作用引起细胞一系列复杂的生理生化反应的过程，要诱导产生某种特异类型的分化细胞，必须了解各种因子的具体作用及作用的时间；且抑制分化的因子最佳剂量和搭配也需进一步研究；如何实现分化的和未分化的ESCs，也需深入探讨。

6.2 移植排斥反应的问题
在人类胚胎干细胞的移植过程中，由于供体与受体ABO血型抗原以及HAL组织相容性抗原的不同而诱发产生排斥反应，目前的主要解决方法有：（1）建立ESCs库，提供多个主要组织相容性抗原位点以供MHC配型的需要。（2）建立普遍适用的供体细胞系，对MHC进行遗传学修饰。（3）用同源重组方法，通过核移植将受体MHC基因导入ESCs。（4）微囊化基因修饰细胞移植技术。通过基因转染技术将目的基因导入到靶细胞内，再将该细胞微囊化后植入受体体内，这样组织相容性好，避免了机体的排斥反应。

6.3 细胞或组织移植到体内后细胞存活、畸胎瘤问题
未分化的多能干细胞是主要原因，为防止畸胎瘤，应选择ESCs特异标志基因阴性的细胞移植或是进行“细胞选择”排除多余多能干细胞的影响。

6.4 政府对于干细胞政策
政治是干细胞研究最大的障碍，牵涉人类成体胚胎干细胞研究既无争议也无限制，但成体干细胞的能力是最缺乏验证的。许多科学家相信胚胎干细胞可提供更有效治疗，但在评估和利用胚胎干细胞时，最大的阻碍是缺乏自由和经费不足。

6.5 社会伦理道德
胚胎干细胞的研究，由于其涉及生命定义及来源，因此极负争议，用可能发展成生命的受精卵做研究，也一再挑战着社会的伦理道德观。站在宗教界的立场，当受精卵产生的那一霎那，就已经有生命的产生，胚胎拥有的权力应该和胎儿一样，任何有机会发展成生命的胚胎都应该受到保护。事实上，为了试管婴儿就可以牺牲胚胎，为了维护个人自主选择权就可以堕掉胎儿的堕胎合法化，若延续胚胎具有生命的概念，则这些又算什么？胚胎干细胞的改变若称为违反自然，对抗疾病、基因工程的研究是否有继续下去的必要？从极端的角度而言，利用医学的力量延长寿命也是一种违反自然的作法。也因此，一些传统保守的道德观念，如反堕胎合法化，反对干预自然、反对扮演上帝角色的观点等，也使得在法理上可能不具异议的胚胎干细胞研究，却面临了传统道德价值观的强烈质疑。
转基因技术、基因疗法、人类和其他物种基因组破译、胚胎干细胞技术等，这一切都提示21世纪将是一个生物世纪，而胚胎干细胞的全部潜能也将在基因技术等先进技术帮助下逐一得到展现。